Zawartość
- Enzymy i witryny z ograniczeniami
- Właściwa orientacja
- Ligacja lepkich końców wymaga mniej DNA
- Różne enzymy mogą dawać ten sam lepki koniec
Klonowanie molekularne jest powszechną metodą biotechnologiczną, którą powinien znać każdy student i badacz. Klonowanie molekularne przy użyciu rodzaju enzymu zwanego enzymem restrykcyjnym do cięcia ludzkiego DNA na fragmenty, które można następnie wstawić do plazmidowego DNA komórki bakteryjnej. Enzymy restrykcyjne przecięły dwuniciowy DNA na pół. W zależności od enzymu restrykcyjnego cięcie może skutkować lepkim końcem lub tępym końcem. Lepkie końce są bardziej przydatne w klonowaniu molekularnym, ponieważ zapewniają, że fragment ludzkiego DNA zostanie wstawiony do plazmidu we właściwym kierunku. Proces ligacji lub łączenie fragmentów DNA wymaga mniej DNA, gdy DNA ma lepkie końce. Na koniec wiele enzymów restrykcyjnych końca może wytwarzać ten sam lepki koniec, nawet jeśli każdy enzym rozpoznaje inną sekwencję restrykcyjną. Zwiększa to prawdopodobieństwo, że region DNA będący przedmiotem zainteresowania może zostać wycięty przez lepkie enzymy końcowe.
Enzymy i witryny z ograniczeniami
Enzymy restrykcyjne to enzymy, które tną rozpoznają specyficzne sekwencje na dwuniciowym DNA i tną DNA na pół w tej sekwencji. Rozpoznana sekwencja jest nazywana miejscem restrykcyjnym. Enzymy restrykcyjne nazywane są endonukleazami, ponieważ przecinają dwuniciowy DNA, tak jak zwykle DNA istnieje, w miejscach, które znajdują się między końcami DNA. Istnieje ponad 90 różnych enzymów restrykcyjnych. Każdy rozpoznaje odrębną witrynę z ograniczeniami. Enzymy restrykcyjne przecinają swoje miejsca restrykcyjne 5000 razy wydajniej niż inne miejsca, których nie rozpoznają.
Właściwa orientacja
Enzymy restrykcyjne występują w dwóch ogólnych klasach. Tną DNA na lepkie lub tępe końce. Lepki koniec ma krótki region nukleotydów, budulców DNA, który jest niesparowany. Ten niesparowany region nosi nazwę zwisu. Mówi się, że zwis jest lepki, ponieważ chce i połączy się z innym lepkim końcem, który ma komplementarną sekwencję zwisu. Lepkie końce są jak dawno utracone bliźniaki, które chcą się mocno przytulić, gdy się spotkają. Z drugiej strony tępe końce nie są lepkie, ponieważ wszystkie nukleotydy są już sparowane między dwiema niciami DNA. Zaletą lepkich końców jest to, że fragment ludzkiego DNA może zmieścić się w bakteryjnym plazmidzie tylko w jednym kierunku. W przeciwieństwie do tego, jeśli zarówno ludzkie DNA, jak i plazmid bakteryjny mają tępe końce, ludzki DNA można wprowadzić do plazmidu od stóp do głów lub od ogona do głowy.
Ligacja lepkich końców wymaga mniej DNA
Chociaż DNA ze sztyftowymi końcami łatwiej jest sobie znaleźć ze względu na ich „lepkość”, ani lepkie końce, ani tępe końce nie mogą się stopić w ciągły kawałek DNA. Tworzenie ciągłego fragmentu DNA, który jest całkowicie połączony, wymaga enzymu zwanego ligazą. Ligazy łączą szkielety nukleotydów na lepkich lub tępych końcach, tworząc ciągły łańcuch nukleotydów. Ponieważ lepkie końce znajdują się szybciej ze względu na ich przyciąganie do siebie, proces ligacji wymaga mniej ludzkiego DNA i mniej plazmidowego DNA. Tępe końce DNA i plazmidów rzadziej się odnajdują, a zatem podwiązanie tępych końców wymaga umieszczenia większej ilości DNA w probówce.
Różne enzymy mogą dawać ten sam lepki koniec
Miejsca restrykcyjne są zlokalizowane w całym genomie organizmów, ale nie są równomiernie rozmieszczone. W plazmidach można je zaprojektować tak, aby znajdowały się tuż obok siebie. Naukowcy, którzy chcą wyciąć fragment ludzkiego DNA z ludzkiego genomu, muszą znaleźć miejsca restrykcyjne znajdujące się z przodu i z tyłu regionu fragmentu. Oprócz zapewnienia wstawienia fragmentu DNA we właściwym kierunku, różne enzymy z lepkim końcem mogą stworzyć ten sam lepki koniec, nawet jeśli rozpoznają różne sekwencje restrykcyjne. Na przykład BamHI, BglII i Sau3A mają różne sekwencje rozpoznawania, ale wytwarzają ten sam lepki koniec GATC. Zwiększa to prawdopodobieństwo, że będą lepkie miejsca restrykcyjne, które będą flankować twój gen będący przedmiotem zainteresowania.