Zawartość
- Zaleta: wrażliwość
- Zaleta: specyficzność
- Wada: podatna na fałszywe lub subiektywne wyniki
- Wada: wysokie koszty i zapotrzebowanie techniczne
Western blot, technika analityczna stosowana do ustalenia konkretnego białka w danej próbce, wykorzystuje zdolność enzymu lub przeciwciała pierwotnego znakowanego fluorescencją do wiązania się z jego specyficznym antygenem. Jest to trzyetapowy proces rozpoczynający się od elektroforezy żelowej, po której następuje blotting i sondowanie przeciwciałami. Wykrywanie białka może być bezpośrednie lub pośrednie, przy czym ten drugi wykorzystuje znakowane przeciwciało wtórne skierowane przeciwko pierwszorzędowemu. Chociaż jest to akceptowana jako rutynowa technika analizy białek, Western blot ma zarówno ograniczenia, jak i zalety.
Zaleta: wrażliwość
Jednym z największych argumentów na korzyść western blot jest jego wrażliwość. Ze względu na jego zdolność do wykrywania zaledwie 0,1 nanograma białka w próbce, technika może teoretycznie służyć jako skuteczne wczesne narzędzie diagnostyczne, wykrywające nawet najmniejszą odpowiedź immunogenną wirusa lub bakterii w próbce pacjenta. Pośredni western blot dodatkowo wykorzystuje tę czułość ze zdolności drugiego przeciwciała do wzmocnienia intensywności sygnału wykrytego przez system obrazowania. Większa czułość oznacza, że do testowania potrzeba mniej przeciwciał, co znacznie obniża koszty laboratoryjne.
Zaleta: specyficzność
Technika western blot zawdzięcza swoją specyfikę dwóm dużym czynnikom. Po pierwsze, elektroforeza żelowa sortuje próbkę na białka o różnej wielkości, ładunku i konformacji. Ten proces sam w sobie jest ogromnym krokiem w kierunku wykrycia, ponieważ prążki utworzone w żelu już dają wskazówki na temat wielkości białka lub polipeptydu będącego przedmiotem zainteresowania. Swoistość interakcji przeciwciało-antygen służy jako drugi duży czynnik. Ponieważ specyficzne przeciwciała wykazują powinowactwo do specyficznych białek, proces może selektywnie wykrywać białko docelowe nawet w mieszaninie 300 000 różnych białek.
Wada: podatna na fałszywe lub subiektywne wyniki
Mimo swojej wrażliwości i swoistości western blot może nadal dawać błędne wyniki. Wynik fałszywie dodatni, gdy przeciwciało reaguje z białkiem nieprzewidzianym, co często zdarza się, gdy pacjent badany na obecność wirusa HIV ma gruźlicę lub szereg zakażeń pasożytniczych. Z drugiej strony wynik fałszywie ujemny może łatwo powstać, jeśli większe białka nie będą miały wystarczającego czasu na prawidłowe przeniesienie do błony. Nieprawidłowe wycieranie i przetwarzanie często powoduje wypaczenie, wyblaknięcie lub nawet wiele pasm, co powoduje, że wyniki testów podlegają interpretacji technika.
Wada: wysokie koszty i zapotrzebowanie techniczne
Koszt western blot stanowi połączenie dużych indywidualnych wydatków na znakowane przeciwciała, wykwalifikowanych analityków i sprzęt laboratoryjny. Delikatny proces, western blotting, wymaga dokładności na każdym etapie do prawidłowej identyfikacji składników próbki. Drobny błąd w stężeniu odczynnika lub w okresie inkubacji może mieć katastrofalne skutki dla całego procesu. Wreszcie sprzęt wymagany do wykrywania i obrazowania - systemy chemiluminescencyjne, fluorescencyjne, radioaktywne lub laserowe - może być zbyt drogi dla przeciętnej jednostki mikrobiologicznej.