Zawartość
W elektroforezie żelowej próbki DNA lub białek są oddzielane - zazwyczaj na podstawie wielkości - przez zastosowanie pola elektrycznego, które powoduje migrację ich przez żel. Zastosowanie elektroforezy żelowej jest rutynowe w biomedycznych laboratoriach badawczych i służy do odpowiedzi na wiele różnych pytań, więc nie ma tak naprawdę uniwersalnego sposobu analizy wyników.
Różne techniki, takie jak na przykład Western, Northern i Southern, obejmują na przykład elektroforezę żelową.
Jeśli wykonujesz elektroforezę próbek DNA na żelu agarozowym, co jest najczęstszym rodzajem procedury, zazwyczaj musisz wykonać co najmniej dwie rzeczy: 1) odróżnić niepocięte plazmidy od wstawek, plazmidów naciętych i plazmidów ciętych, oraz 2) oszacować rozmiar różnych Fragmenty DNA ze standardowym programem Excel lub kalkulatorem.
Oto jak to działa.
Sprawdź notatnik laboratoryjny, aby ustalić, które próbki zostały załadowane na które linie. Po załadowaniu dołków do żelu powinieneś zanotować tożsamość każdej linii / próbki.
Ustal, która linia zawiera „drabinę” standardów DNA. Są to fragmenty o znanej długości; odległość ich migracji może być wykorzystana do określenia wielkości fragmentów próbki za pomocą standardowej krzywej Excel lub innego kalkulatora.
Za pomocą linijki zmierz odległość na zdjęciu od studzienek do barwnika śledzącego, który będzie podróżował dalej niż którykolwiek z pasm DNA (innymi słowy, będzie na dnie żelu). Zapisz tę liczbę - używane jednostki nie są ważne.
Zmierz odległość na zdjęciu od dołków do każdego z pasm w „drabinie”, a następnie podziel tę odległość przez odległość przebytą przez pasmo barwnika śledzącego. To obliczenie daje względną mobilność każdego pasma.
Przykład: Załóżmy, że pasmo barwnika śledzącego podróżowało 6 cali, a my mamy trzy pasma, które podróżowały 5, 4,5 i 3,5 cala.
Jaka jest ich względna mobilność? Odpowiedź: Dzielimy 5, 4,5 i 3,5 przez 6, aby uzyskać względne ruchliwości wynoszące 0,833, 0,75 i 0,5833.
Wprowadź względne mobilności do swojego programu arkusza kalkulacyjnego (Excel lub innego podobnego programu, którego używasz) wraz z rozmiarem w kilobazach każdego fragmentu w drabinie.
Producent podaje rozmiar każdego fragmentu w drabinach, które dostarczają, więc powinieneś już mieć te informacje.
Wykres danych z względną ruchliwością na xi rozmiarem w kilobazach na y.
Użyj funkcji Trendline w programie do obsługi arkuszy kalkulacyjnych, aby dopasować równanie do danych. To równanie powinno być równaniem mocy (np. X ^ -2) i powinno stosunkowo dobrze pasować do danych (współczynnik R co najmniej 0,9). To tworzy krzywą i krzywą standardową Excel.
Spójrz na pasma odpowiadające twoim próbkom.
Pamiętaj, że mniejsze fragmenty DNA podróżują dalej przez żel niż duże fragmenty DNA, więc te najbliższe barwnikowi śledzącemu będą najmniejsze. Należy jednak pamiętać, że jeśli plazmidowe (okrągłe) DNA nie zostanie pocięte, stanie się „superskręcone” lub skręcone jak przewód telefoniczny, co w rzeczywistości spowoduje jego przemieszczanie dalej niż liniowy DNA tej samej wielkości.
Podobnie „nacięty” plazmid, który został niecałkowicie przecięty, będzie podróżował krótszy odległość niż liniowy DNA tej samej wielkości. W związku z tym nie można oszacować wielkości niepociętych plazmidów z żelu.
Dopasuj prążki na każdym torze z tożsamością próbki załadowanej na ten tor i ustal, czy to, co widzisz, jest tym, czego możesz się spodziewać. Będzie to zależeć od charakteru eksperymentu.
Ogólnie jednak, jeśli trawi się plazmid wstawki dwoma enzymami restrykcyjnymi, można oczekiwać, że wstawka zostanie uwolniona od plazmidu.
Ponieważ jest on znacznie mniejszy niż plazmid, można oczekiwać, że zobaczysz dwa pasma na tym pasie, jeden u góry i drugi u dołu. Plazmid cięty tylko jednym enzymem restrykcyjnym powinien tworzyć tylko pojedyncze pasmo, które przemieszcza się nieco dalej niż plazmid cięty dwoma enzymami restrykcyjnymi, ale nigdzie w pobliżu wkładki.
Zmierz odległość od dołków do wyciętego plazmidu i wstaw linijki za pomocą linijki. Podziel te liczby przez odległość przebytą przez barwnik śledzący, aby znaleźć względną ruchliwość wstawek i ciętych plazmidów.
Podłącz względną ruchliwość wstawek i wycinanych plazmidów do równania obliczonego dla ciebie przez arkusz kalkulacyjny. To obliczenie powinno dać oszacowanie wielkości tych plazmidów.