Zawartość
Wysokosprawna chromatografia cieczowa jest techniką laboratoryjnej analizy mieszaniny. Jest to skuteczny rodzaj chromatografii, który wykorzystuje wysokie ciśnienie, a nie tylko grawitację, do napędzania próbki mieszaniny przez kolumnę. Próbka jest wstrzykiwana, a następnie pompa o wysokim ciśnieniu pomaga przesuwać próbkę wzdłuż upakowanej kolumny, gdzie jest ona dzielona na poszczególne składniki. Ten rozdział jest następnie analizowany przez detektor w celu uzyskania wyników.
Miejsce wstrzyknięcia
W celu wstrzyknięcia do HPLC próbkę najpierw należy rozpuścić w polarnym ciekłym rozpuszczalniku, najlepiej takim o znanych widmach HPLC, aby można było odróżnić jego dane od próbek. Ciekły roztwór zawierający próbkę umieszcza się w urządzeniu i przesyła do kolumny. Rzeczywista lokalizacja miejsca wstrzyknięcia zależy od marki instrumentów. W większości przypadków proces wstrzykiwania jest zautomatyzowany, ale w niektórych przypadkach pracownik laboratorium musi wstrzyknąć próbkę za pomocą małej igły strzykawki.
Komponent pompy
Komponent pompy jednostki HPLC jest niezbędny, ponieważ zapewnia ciśnienie, które napędza próbkę przez kolumnę. Siła pompy jest różna, ale mocna może wytworzyć ciśnienie do 6000 psi lub funtów na cal kwadratowy, które jest stosowane po wstrzyknięciu próbki. Dzięki temu próbka przechodzi przez kolumnę szybciej i wydajniej niż gdyby kapała, wykorzystując jedynie siłę grawitacji.
Opis kolumny
Zwiększona prędkość próbki przepuszczanej przez kolumnę przez pompę pozwala na zastosowanie innego rodzaju kolumny niż te stosowane w prostej chromatografii cieczowej. Materiał wypełniający w kolumnie może mieć znacznie mniejszy rozmiar cząstek, co zwiększa pole powierzchni, a zatem wspomaga interakcje próbki z kolumną. Większość kolumn HPLC działa poprzez polaryzację. Próbka jest rozpuszczana w polarnym rozpuszczalniku, a kolumna składa się głównie z niepolarnych węglowodorów. Polarne części cząsteczki próbki przechodzą bardzo szybko przez kolumnę, ponieważ przede wszystkim oddziałują z rozpuszczalnikiem, podczas gdy próbki składników niepolarnych pozostają w kolumnie, tworząc słabe interakcje ze składnikami kolumny. Dlatego składniki próbek schodzą z kolumny w kolejności od większości polarnych do większości niepolarnych.
Funkcja detektora
Detektory różnią się również w zależności od rodzaju używanego przyrządu HPLC. Jednak większość funkcjonuje w ten sam podstawowy sposób. Źródło światła ultrafioletowego świeci na oddzielone składniki próbki, gdy opuszczają kolumnę. Większość związków organicznych pochłania pewną ilość światła, więc przechodząc przez przyłożoną wiązkę światła, detektor może wykryć, ile światła jest pochłaniane. Detektor rejestruje również czas retencji składników na podstawie kolejności, w jakiej wypadają z kolumny. Wynik ten można następnie analizować na podstawie powierzchni piku, aby określić dokładny charakter składników próbek.