Zawartość
- Jak działa elektroforeza żelowa
- Podstawowa procedura elektroforezy
- Określanie długości nieznanych fragmentów
Jeśli chodzi o pomiar długości fragmentów DNA, które są znacznie mniejsze niż komórki, mikrobiologowie potrzebują sztuczki, a najbardziej dogodna jest elektroforeza żelowa. Ta metoda opiera się na tym, że fragmenty DNA są naładowane, i jest alternatywą dla droższych metod, takich jak krystalografia rentgenowska, która była odpowiedzialna za odkrycie struktury podwójnej helisy DNA.
Jak działa elektroforeza żelowa
Ponieważ cząsteczki DNA są naładowane, wpływa na nie prąd elektryczny. Po ustawieniu ich w neutralnym żelu i umieszczeniu prądu w żelu cząsteczki migrują w kierunku elektrody dodatniej (anody). Ponieważ cząsteczki DNA o różnych rozmiarach przenoszą ten sam ładunek, mniejsze przemieszczają się szybciej, więc proces ten dzieli cząsteczki na pasma, które można porównać z próbkami o znanych rozmiarach.
Podstawowa procedura elektroforezy
Żel jest zwykle wytwarzany z agarozy, polisacharydu, który po podgrzaniu w roztworze buforowym tworzy półstały, lekko porowaty żel. Na jednym końcu żel tworzy małe wgłębienia zwane studniami, w których badacz umieszcza badane próbki DNA wraz z próbkami odniesienia o znanej długości, zwanymi drabinką DNA. Długości fragmentów drabiny zostały wcześniej określone inną metodą, taką jak krystalografia rentgenowska.
Kiedy żel zanurza się w roztworze przewodzącym i przykłada napięcie, fragmenty zaczynają migrować przez żel - najpierw mniejsze, a większe za nimi wolniejsze. W końcu formują się w pasma podobne do widma w zależności od wielkości.
Gdy to nastąpi, badacz wyłącza moc, napełnia żel barwnikiem wiążącym DVA i bada próbki w świetle ultrafioletowym. Wykorzystując drabinę jako odniesienie, badacz może określić rozmiar każdego z fragmentów w widocznym pasku. Widoczne są tylko prążki - pojedyncze fragmenty DNA są zbyt małe, aby je zobaczyć.
Określanie długości nieznanych fragmentów
Nie wszystkie szanse w parze w parze z pasmem na drabinie, więc aby określić rozmiary tych nieznanych fragmentów, naukowcy zwykle wykreślają wykres. Na osi x jest odległość przebyta przez każde pasmo w drabinie w milimetrach, podczas gdy na osi y jest rozmiar każdego pasma. Gdy punkty są połączone krzywą, wielkość dowolnego pasma można ekstrapolować z krzywej po zmierzeniu odległości przebytej przez to pasmo w milimetrach.