Zawartość
DNA
Kwas deoksyrybonukleinowy i białka. DNA jest zorganizowane w jednostki zwane genami, z których każdy koduje określoną sekwencję RNA lub białka. Geny są badane w celu poznania struktury biologicznej i funkcji, ewolucji, chorób i wielu innych aspektów żywych systemów. Aby szczegółowo zbadać geny, DNA musi zostać wyizolowane i oczyszczone z interesujących komórek.
Ekstrakcja DNA
Chociaż DNA z pojedynczej komórki można pobrać i zbadać, nie wystarczy zobaczyć gołym okiem. Aby uzyskać ilość wystarczającą do buforowania, im więcej komórek musisz pracować, tym lepiej (wiele milionów).
Dokładne protokoły różnią się znacznie, aby uwzględnić unikalne cechy określonych próbek, ale ogólne etapy to homogenizacja, lizy, trawienie, separacja i zbieranie. Procedurę najlepiej przeprowadzić w małej (w zależności od wielkości próbki) szklanej lub plastikowej rurce.
Próbka jest na ogół mieszana lub mielona, aby dokładnie oddzielić komórki od siebie. To sprawia, że składniki komórki są bardziej dostępne dla następujących odczynników. Detergent lub enzymy są następnie dodawane do homogenatu w celu lizy błon komórkowych (i błon jądrowych, jeśli komórki są eukariotyczne) w celu uwolnienia DNA. W tym momencie DNA jest otoczony białkami, lipidami, węglowodanami - wszystkim innym, co było zawarte w komórkach.
Konieczne może być dalsze trawienie enzymatyczne w celu rozbicia białek, aby nie wiązały się one z DNA i nie zakłócały jego gromadzenia. DNA oddziela się od reszty zawartości komórki przez dodanie zimnego, czystego alkoholu etylowego lub izopropylowego. DNA nie jest rozpuszczalny w tych alkoholach, więc kondensuje się, próbując zminimalizować jego kontakt z alkoholem. Skondensowane DNA jest następnie zbierane, zwykle przez wirowanie --- lub buforowanie.
Buforowanie DNA
Zbieranie DNA przez buforowanie jest skuteczne, gdy duża ilość DNA jest uzyskiwana z procedury ekstrakcji. Jest to również doskonała metoda demonstracyjna, ponieważ imponująca plątanina czystego DNA jest wyraźnie widoczna.
Aby buforować DNA, etap separacji należy przeprowadzić ostrożnie. Jeśli nie była to część wcześniej dodanej mieszaniny odczynników do lizy, stężony roztwór soli (chlorek sodu) należy dodać do roztworu przed etapem dodawania alkoholu. Zimny alkohol powoli wlewa się z boku probówki, aby utworzyć warstwę na wodnym roztworze, unikając mieszania. Jeśli zostanie to wykonane poprawnie, alkohol utworzy własną warstwę na wierzchu warstwy słonej. Potem przychodzi buforowanie.
Aby zebrać DNA z warstwy słonej, ostrożnie umieść szklany pręt mieszający przez warstwę alkoholu, aż dotknie dna probówki. Powoli obróć pręt między palcami, obserwując interfejs między dwiema warstwami. Jeśli obecna jest wystarczająca ilość DNA, zbija się w styku między warstwami, tworząc mleczną półprzezroczystą masę. Zakręć prętem, aby owinąć wokół niego DNA (to jest część buforowania) i wyciągnij go z tuby. DNA można przenieść do innej probówki z czystym alkoholem w celu przechowywania lub dalszej analizy.