Zawartość
Elektroforeza żelowa to technika, która pozwala analizować DNA na poziomie jego cząsteczek składowych. W tej metodzie wizualizacji DNA próbki umieszcza się na podłożu z żelem agarozowym i na żel przykłada się pole elektryczne. Powoduje to migrację fragmentów DNA przez żel z różną szybkością, zgodnie z ich właściwościami elektrochemicznymi.
Bromek etydyny
W tej technice wizualizacji bromek etydyny miesza się z proszkiem agarozowym, buforem EDTA i wodą z utworzeniem matrycy żelowej przed elektroforezą. W rezultacie cząsteczki bromku etydyny są równomiernie rozproszone w matrycy. Po wypełnieniu studzienek żelowych odpowiednimi próbkami DNA i barwnikami śledzącymi przykładane jest napięcie, aby powoli przeciągać duże, polarne związki przez matrycę.
Podczas tego ruchu zasady cząsteczek DNA tymczasowo wiążą się z cząsteczkami dzięki ładunkowi bromku etydyny, ciągnąc je ze sobą. Do czasu elektroforezy żelowej każda cząsteczka DNA wychwyciła znaczną ilość bromku etydyny.
W obecności światła ultrafioletowego bromek etydyny wykazuje fluorescencję. Technicy oświetlają żel specjalnie skalibrowanym światłem UV, podczas gdy urządzenie rejestruje zdjęcie świecących fragmentów.
Błękit metylenowy
Jeśli transiluminator UV nie jest dostępny lub praktyczny, technicy mogą uczynić DNA widocznym w normalnych warunkach, zanurzając gotowy żel agarozowy z elektroforezowanym DNA w środku w roztworze błękitu metylenowego przez noc.
Sól chlorkowa z wyraźnie hydrofobowym anionem, cząsteczki błękitu metylenowego przenikają całą matrycę żelową. Jednak wiązanie wodoru w DNA powoduje akumulację cząsteczek plam. Ta zwiększona gęstość plam DNA daje głębszy odcień niebieskiego, widoczny gołym okiem.
Barwniki śledzące
Poza względną wielkością pasm DNA, technicy mogą zmierzyć wielkość bezwzględną (w parach zasad) każdego fragmentu za pomocą substancji chemicznych zwanych barwnikami śledzącymi. Widoczne bez dodatku błękitu metylenowego lub bromku etydyny, barwniki śledzące, takie jak błękit bromofenolowy i cyjan ksylenowy, poruszają się po matrycach żelu aragozowego podczas elektroforezy z taką samą prędkością jak fragmenty DNA składające się odpowiednio z 300 nukleotydów i 4000 nukleotydów. W elektroforezie bardziej masywne fragmenty DNA przemieszczają się po matrycy żelowej z mniejszą prędkością niż mniejsze fragmenty. Dlatego, chociaż barwniki śledzące nie wpływają bezpośrednio na widoczność fragmentów DNA, porównanie pozycji fragmentu DNA w żelu z pozycją tych barwników pozwala technikom „zobaczyć” przybliżoną liczbę nukleotydów zawartych w tym fragmencie DNA.