Zawartość
W reakcjach chemicznych katalizowanych przez enzym enzym obniża ilość energii aktywacji wymaganej przez tymczasowe związanie z substratem i skręcenie go do stanu napiętego. K (katalizator) lub „kcat” dla reakcji odnosi się do stałej niezależnej od stężenia dla szybkości, z jaką dany enzym może metabolizować substrat do cząsteczki produktu. Aby obliczyć kcat, naukowcy najpierw mieszają kilka probówek o różnych stężeniach substratu (znanych jako „test enzymatyczny”) i testują je w stałych odstępach czasu za pomocą spektrofotometru świetlnego w celu pomiaru rosnących stężeń cząsteczek produktu. Dane te są następnie wykreślane na wykresie i analizowane.
Obliczanie prędkości początkowych
Wykreślić wykres stężenia produktu w funkcji czasu dla danych z pierwszej próby testowej w testach enzymatycznych. Uwaga: oś pozioma powinna być „czasem”, a oś pionowa powinna być „stężeniem produktu”.
Oblicz linię regresji liniowej dla punktów danych wykreślonych w Rozdziale 1, Krok 1. Podczas gdy Excel i kalkulatory graficzne mogą łatwo ustalić ten model liniowy, możesz oszacować nachylenie linii regresji, dzieląc różnicę stężenia produktu między sąsiednimi danymi punkty różnicą w czasie.
Zapisz nachylenie linii regresji liniowej z Sekcji 1, Krok 2 jako „początkowa prędkość reakcji (Vo)”. Uwaga: w modelu linii regresji „= m + b” „współczynnik” m to nachylenie.
Powtórz kroki 1, 2 i 3 dla pozostałych probówek w teście.
Obliczanie Vmax
Wykreślić odwrotność stężenia substratu dla każdej probówki w stosunku do odwrotności jej początkowej prędkości reakcji (z Sekcji 1, Krok 4). Na przykład, jeśli początkowa prędkość dla probówki o początkowym stężeniu substratu 50 mikromoli (uM) wynosiła 80 uM / s, inwersje wynosiłyby 1/50 uM dla stężenia substratu i 1/80 uM / s dla początkowego prędkość. Uwaga: odwrotne stężenie podłoża powinno znajdować się na osi poziomej, a odwrotna prędkość początkowa powinna znajdować się na osi pionowej.
Uwaga: stężenie substratu powinno być na osi poziomej, a początkowa prędkość reakcji powinna być na osi pionowej.
Określ linię regresji liniowej dla wykresu wykreślonego w sekcji 2, krok 1. Uwaga: ponieważ musisz znać przecięcie y dla linii regresji, powinieneś wprowadzić punkty z sekcji 2, krok 1 do Excela lub kalkulator graficzny i skorzystaj z wbudowanej funkcji modelowania regresji.
Podziel 1 przez przecięcie y z linii regresji liniowej. To da ci wartość odwrotności Vmax, maksymalnej prędkości reakcji dla enzymu. Uwaga: jeśli model regresji liniowej przyjmuje postać „= m + b”, wówczas wartością „b” byłoby przecięcie y. Podziel 1 przez „b”, aby obliczyć odwrotność Vmax.
Podziel 1 przez wynik z Sekcji 2, Krok 3, aby obliczyć rzeczywistą wartość Vmax.
Określić stężenie enzymu w pierwotnym teście (patrz surowe dane). Uwaga: stężenie enzymu jest takie samo dla wszystkich probówek; tylko stężenia substratu różnią się w teście.
Podziel Vmax (z Sekcji 2, Krok 4) przez stężenie enzymu (z Sekcji 2, Krok 5). Wynikiem jest wartość Kcat.