Zawartość
Błękit genetyczny komórki jest zakodowany w materiale genetycznym lub DNA. Ponieważ DNA nigdy nie opuszcza jądra komórki, aby ta informacja dostała się do cytoplazmy, w której znajdują się inne białka i składniki biochemiczne, konieczne jest najpierw transkrypcję DNA na informacyjny RNA (mRNA lub poli (A) RNA). Ten mRNA przekształca się następnie w białka, które pełnią wiele funkcji komórki. Aby wykryć lub określić ilościowo bardzo rzadkie mRNA, wykonać sondy do mikromacierzy lub skonstruować biblioteki komplementarnych cząsteczek DNA, mRNA musi zostać wyizolowany. Jednak całkowita ekstrakcja RNA (tj. Cały RNA w komórce), a następnie izolacja mRNA nie są procesami wzajemnie się wykluczającymi; to pierwsze należy wykonać, aby mRNA został wyekstrahowany.
Izolacja mRNA z całkowitego RNA
Homogenizacja TRIzolu: Całkowity RNA obejmuje wszystkie mRNA, transfer RNA, rybosomalny RNA i inne niekodujące RNA. Aby oddzielić je od innych składników komórkowych, najpierw otwiera się komórkę w celu uwolnienia jej zawartości. Odbywa się to przez ponowne zawieszenie komórek osadzonych przez wirowanie (wirowanie przy dużych prędkościach) w odczynniku TRIzol (Life Technologies). Inne wersje TRIzolu (takie jak odczynnik TRI Ambion) działają podobnie.
Całkowita izolacja RNA: Do oddzielenia różnych składników (białek, DNA, RNA) komórki na warstwy lub fazy w zawiesinie stosuje się serię wirowań. Górna, żółta faza składa się z tłuszczu i można ją wyrzucić. Pożądana faza jest zabarwiona na czerwono, zawiera całkowity RNA i zostaje zachowana. Po przeprowadzeniu ekstrakcji fenol-chloroform i serii przemywania alkoholu za pomocą izopropanolu i etanolu RNA można granulować w celu izolacji mRNA. Dodaj inhibitory RNazy, aby zapobiec degradacji tego enzymu przez całkowity RNA.
Ekstrakcja mRNA: Często stosuje się zestaw do izolowania mRNA, ponieważ domowe protokoły laboratoryjne nie generują dużych ilości wysoce oczyszczonych mRNA. Zestawy komercyjne obejmują InvTrogen FastTrack 2.0 lub Ambion's Poly (A) Pure mRNA Isolation Kit. Te podstawowe kroki są wspólne dla takich zestawów:
a) Wymieszaj bufor lizujący inhibitowany RNazą dostarczony w zestawie z maksymalnie 300 mikrolitrami całkowitego RNA.
b) Ogrzewać przez 5 minut w temperaturze 65 stopni Celsjusza, a następnie natychmiast schłodzić próbkę na lodzie przez jedną minutę.
c) Wymieszaj z 0,5 M chlorkiem sodu, a następnie całkowicie rozpuść Oligo dT (kwas oligodeoksytymidylowy) w tej próbce.
d) Odwiruj tę próbkę i odzyskaj supernatant, który przemywa się kilka razy w szeregu buforów wiążących i o niskiej zawartości soli zawartych w zestawach.
e) Eluować mRNA kilka razy, aż do uzyskania określonej objętości zestawu (np. 500 mikrolitrów).
f) Wytrącić eluat przez strącanie octanem sodu i etanolem. Zawiesić ponownie w maksymalnie 20 mikrolitrach wody poddanej obróbce z użyciem pirowęglanu dietylu (DEPC).
g) Przechowywać w temperaturze -80 stopni Celsjusza i sprawdzić jakość i ilość za pomocą spektrofotometrii.